adsbiotec mRNA聚（A）尾蛋白中的磷酸二酯修飾簡(jiǎn)介

不影響蛋白質(zhì)表達(dá)的去烯基化

多米尼卡·斯特澤萊卡，1,3米羅斯勞·斯米坦斯基，2,3帕維爾·J·西科爾斯基，2馬辛·沃明斯基，1
1歲的喬安娜·科瓦爾斯卡和2歲的雅切克·杰米利特
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波蘭華沙02-093華沙大學(xué)物理系實(shí)驗(yàn)物理研究所生物物理系
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華沙大學(xué)新技術(shù)中心，波蘭華沙02-097
摘要化學(xué)修飾使mRNAs的制備具有更高的穩(wěn)定性和翻譯活性。在本研究中，我們探索了mRNA體和聚（A）尾中5′、3′磷酸二酯鍵的化學(xué)修飾如何影響真核mRNA的生物學(xué)特性。為了獲得修飾和未修飾的體外轉(zhuǎn)錄mRNAs，我們使用ATP和
在α-磷酸（包含O-to-S或O-to-BH3替換）和三種不同的RNA聚合酶-SP6、T7和聚（A）聚合酶處修飾的ATP類(lèi)似物。為了驗(yàn)證ATP類(lèi)似物在ATP存在下的摻入效率，我們開(kāi)發(fā)了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，用于基于轉(zhuǎn)錄物*降解為5′-單核苷酸的定量評(píng)估修飾頻率。該方法還估計(jì)了平均聚（A）尾長(zhǎng)度，因此為建立mRNA的結(jié)構(gòu)-生物學(xué)特性關(guān)系提供了一個(gè)通用工具。我們發(fā)現(xiàn)，與未修飾的mRNA相比，在聚（A）尾中含有硫代磷酸基團(tuán)的mRNA更不易被3′-dedenylase降解，并在培養(yǎng)細(xì)胞中有效表達(dá)，這使它們成為有用的研究工具和未來(lái)基于mRNA的療法發(fā)展的潛在候選。
關(guān)鍵詞：去烯基化；mRNA修飾；抵抗；轉(zhuǎn)錄；翻譯

由于應(yīng)用分析方法的分辨率差，導(dǎo)致ITE長(zhǎng)度增加，這又因多聚（A）尾異質(zhì)性而變得復(fù)雜（Jalkanen等人，2014年）。最高分辨率測(cè)序方法，如TAIL-seq（Chang等人。
PAlso-seq（Subtelny等人2014年；Liu等人2019年）和FLAM-seq（Legnini等人2019年）提供了關(guān)于核苷酸序列、聚（A）尾長(zhǎng)度和腺嘌呤修飾存在的信息。質(zhì)譜分析
通過(guò)直接注入分析或結(jié)合色譜技術(shù)成功地用于RNA（包括mRNA）分析（Kowalak等人，1993年；
Gong和McCullagh 2014；Rose等人，2015年；韋策爾和林巴赫2016；Studzinska等人，2017年；Beverly等人，2018年；Lobue等人，2019年；Calderisi等人，2020年）。這種強(qiáng)有力的技術(shù)提供了有關(guān)RNA結(jié)構(gòu)和功能的信息
組成，包括聚（A）尾長(zhǎng)。盡管這是一種高分辨率和敏感的方法，但由于多電荷態(tài)和相關(guān)光譜的復(fù)雜性，長(zhǎng)mRNA的分析可能很困難（Muddiman）
等人，1996年）。
在這項(xiàng)研究中，為了能夠分析P-mod mRNA，我們開(kāi)發(fā)了一種新的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，該方法能夠同時(shí)量化修飾的磷酸化核糖核酸的數(shù)量-
雙酯鍵和mRNA中聚（A）尾平均長(zhǎng)度的估計(jì)（圖1）。隨后，我們應(yīng)用該方法對(duì)攜帶硫代磷酸或磷酸硼砂修飾的IVT P-mod RNA進(jìn)行了表征-
三種不同的RNA聚合酶可以使細(xì)胞大小不同。最后，對(duì)LC–MS/MS表征的P-mod mRNA進(jìn)行了體外研究，以評(píng)估其對(duì)酶促脫烯基化的敏感性，并在培養(yǎng)細(xì)胞中評(píng)估磷酸二酯修飾對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。我們瞥見(jiàn)了P-mod RNA的合成孔徑雷達(dá)，并確定了與高效蛋白質(zhì)表達(dá)兼容的修飾模式。