biosearchtech KASP 基因分型試驗(yàn)試劑盒

我們獲得專有技術(shù)的基于PCR的KASP基因分型化學(xué)方法包括三個(gè)成分：樣品DNA，KASP分析混合物和包含兩個(gè)通用FRET卡盒的KASP Master混合物。

KASP試用套件包含

• 33個(gè)預(yù)稀釋的DNA樣品
• 2X KASP預(yù)混液
• 對(duì)照KASP測(cè)定混合物

從完成的KASP反應(yīng)中讀取熒光信號(hào)所需的全部是具有FRET功能的酶標(biāo)儀或qPCR儀器。

KASP 基因分型試驗(yàn)試劑盒用戶指南

本指南內(nèi)容

1 簡(jiǎn)介

2 試劑盒內(nèi)容物

3 進(jìn)行 KASP 基因分型反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)程序

3.1 KASP 基因分型反應(yīng)

3.2 試劑盒組裝

3.3 KASP 基因分型混合物組裝

3.4 實(shí)驗(yàn)程序

3.5 熱循環(huán)條件

3.6 其他循環(huán)條件

4 訂購(gòu)信息

1. 簡(jiǎn)介

KASP™ 基因分型試驗(yàn)試劑盒作為使用 KASP 化學(xué)品的介紹提供。它使用戶能夠使用現(xiàn)有設(shè)備在自己的實(shí)驗(yàn)室中測(cè)試化學(xué)物質(zhì)。

一般而言，任何能夠在表 1 中波長(zhǎng)處讀取 FRET 的 qPCR 儀器或酶標(biāo)儀均應(yīng)與 KASP 兼容。

KASP 已在廣泛的 qPCR 儀器上得到驗(yàn)證，包括：

• ABI 7500

• ABI 7300

• ABI 7900

• ABI ViiA7

• 羅氏 LC480

• Agilent Mx3000P/3005P

• illumina EcoRT

• BIO-RAD CFX

2. 試劑盒內(nèi)容物

該試劑盒包含 KASP 基因分型檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)混合物、主混合物和 DNA：

1. 1 x 96 孔微量滴定板，含 33 份 DNA 樣品（和 3 份無(wú)模板對(duì)照），預(yù)稀釋至適用于 KASP 基因分型反應(yīng)的濃度范圍。

2. 1 x 500µL 管的 2x 濃度的 KASP 主混合物（足以進(jìn)行 100 次反應(yīng)）

10µL）。

3. 1 x 管 KASP 測(cè)定混合物（72x 濃度）。

客戶要求

1. 快速酶標(biāo)儀（激發(fā)和發(fā)射詳見表 1）

熒光團(tuán)的值）

2. 一個(gè)預(yù)期用于客戶基因分型過(guò)程類型的空 PCR 板

3. PCR 級(jí)水

4. 光學(xué)透明密封件。

表 1：KASP 化學(xué)中使用的熒光團(tuán)及其各自的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。

3. 進(jìn)行 KASP 基因分型反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)程序

3.1 KASP 基因分型反應(yīng)

使用以下試劑制備 KASP 反應(yīng)：

• 2x KASP 預(yù)混液

• 72x KASP 分析混合物

• DNA 樣品（提供正確濃度的樣品 DNA，用于 2x 稀釋）

• 必要時(shí)加水定容至終反應(yīng)體積。

3.2 試劑盒組裝

384 孔板的總反應(yīng)體積需要 5µL，96 孔板的總反應(yīng)體積需要 10µL。

表 2 是如何為 384 和 96 孔板形式的 KASP 構(gòu)建 60 個(gè)反應(yīng)的示例。這將使您能夠?yàn)?33 個(gè)樣本和 3 個(gè)無(wú)模板對(duì)照 (NTC) 制備足夠的基因分型混合物，并提供額外的備用體積。

3.3 KASP 基因分型混合物組裝

表 2：KASP 反應(yīng)組件示例

3.4 實(shí)驗(yàn)程序

1. 解凍 KASP Master mix 和 KASP Assay mix 試管。渦旋每個(gè)試管，并在冰上儲(chǔ)存。

2. 解凍 DNA 板。短暫渦旋并向下旋轉(zhuǎn)微孔板。

3. 使用單通道或多通道移液器將 DNA 轉(zhuǎn)移至空反應(yīng)板（客戶提供）。

- 對(duì)于 96 孔板：將提供的 5µL DNA 轉(zhuǎn)移至各孔中。

- 對(duì)于 384 孔板：將提供的 2.5µL DNA 轉(zhuǎn)移至各孔中。

4. 按照表 2 所述制備基因分型混合物 (2x KASP Master mix plus Assay mix)。向反應(yīng)板中的每個(gè) DNA 樣品中加入所需量的基因分型混合物。該程序可使用單通道或多通道移液器。

- 對(duì)于 96 孔板：向各 DNA 樣本中加入 5µL 制備的基因分型混合物。

- 對(duì)于 384 孔板：向各 DNA 樣本中加入 2.5µL 制備的基因分型混合物。

5. 用光學(xué)透明密封件密封平板。

6. 將微孔板離心至少 550 次x g. 不要以比轉(zhuǎn)子推薦的速度更快的速度旋轉(zhuǎn)微孔板。

3.5 熱循環(huán)條件

KASP 化學(xué)品可以與任何標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀一起使用。熱循環(huán)條件詳見表 3，請(qǐng)注意，使用了兩步降落 PCR 方法，延伸和退火步驟合并為一個(gè)步驟。建議在分配 DNA 和基因分型混合物后盡快循環(huán)反應(yīng)板。如果不可行，制備好的平板可在 4 ℃ 下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá) 1 小時(shí)OC. 平板分裝后應(yīng)立即用光學(xué)透明密封件密封，以防止任何蒸發(fā)。

表 3：KASP 化學(xué)品的熱循環(huán)條件

熱循環(huán)后，讀取微孔板。

請(qǐng)注意：所有平板的讀數(shù)均應(yīng)低于 40OC. 如果微孔板讀數(shù)未低于 40OC，不可能分析基因分型數(shù)據(jù)。

3.6 其他循環(huán)條件

如果您尚未獲得明確的基因分型簇，則應(yīng)將平板熱循環(huán)額外 3 個(gè)循環(huán)，并再次讀取。回收條件請(qǐng)參見表 4。

表 4：KASP 化學(xué)品進(jìn)一步熱循環(huán)的條件

在獲得緊密的基因分型簇之前，可以進(jìn)行進(jìn)一步的循環(huán)和讀取。

圖 1 圖 2

X 軸上報(bào)告的 FAM 等位基因

圖 1：說(shuō)明三個(gè)清晰簇的基因分型圖示例。FAM 等位基因在 X 軸上報(bào)告（藍(lán)色數(shù)據(jù)點(diǎn)），HEX 等位基因在 Y 軸上報(bào)告（紅色數(shù)據(jù)點(diǎn)）。綠色數(shù)據(jù)

點(diǎn)代表雜合子樣本，黑色數(shù)據(jù)點(diǎn)為無(wú)模板對(duì)照 (NTC)。

圖 2：指示 KASP 基因分型試驗(yàn)試劑盒 DNA 樣本預(yù)期基因分型結(jié)果的 96 孔板布局圖。

注：本方案適用于所有三個(gè)試驗(yàn)套件部件編號(hào)。三種試劑盒之間的僅有差異是 KASP 主混合物中被動(dòng)參比染料 ROX 的濃度，其根據(jù)使用的酶標(biāo)儀類型而變化

4. 訂購(gòu)信息